قسمت اول _ بيماری حباب خشک در قارچ خوراکی دکمه ای

 يک تفاوت جزئی بين قارچهای آلوده شده به حباب تر وخشک در اين است که در حباب خشک قطرات خيلی کوچک هستند اما در حباب تر قطرات بزرگ و به تعداد بيشتری هستند که به صورت توده ای بافت قارچ خوراکی را پوشانده اند. در روی کلاهک قارچ ايجاد لکه های نکروتيک با رنگ قهوه ای تيره متمايل به خاکستری می کند، اين لکه ها رشد می کنند و اسپورزايی می کنند که اين خصوصيت به ما در تشخيص بيماری لکه قهوه ای باکتريايی که رنگ لکه های آن قهوه ای مايل به زرد    می باشد و نسبت به لکه های حباب خشک روشن تر هستند، کمک می کند. آلودگی از رشد قارچ جلوگيری می کند و در روی قارچ ايجاد ساقه های منشعب و ترک خورده می کند. ساقه های ترک خورده باعث اختلال در افزايش طول ساقه ها می شود. در آخرين مراحل آلودگی ممکن است ساقه ها به صورت ورم کرده وخميده مشاهده شوند که در اين صورت غير قابل فروش می باشند(6).

اين قارچ همچنين باعث بيماری روی بسياری از قارچهای وحشی می شود. بنابراين عموما اطراف مزارع در طول مدت آب و هوای گرم با آن مواجه می شويم، زمانيکه ساير قارچهای وحشی و کپک ها رشد          می کنند. اين بيماری از مهمترين بيماريهای قارچی مراکز کشت و صنعت پرورش قارچ خوراکی در ايران است. اساسا اين بيماری سه نوع علائم کلی در ميزبانش توليد می کند:

1 - حباب خشک، که در مراحل اوليه رشد اندام باردهی قارچ ( گره اوليه ) بروز کرده و جوشها يا       حباب های خشک کوچکی به صورت توده ای بی شکل يا پيازی شکل که در نهايت با از دست دادن آب خود چرمی و خشک شده و اغلب به قطر 5/0 تا 2 سانتی متر بالغ می شوند (شکل1).

شکل 1-  علائم اوليه بيماری ورتيسيليومی Verticillium fungicola var fungicola روی کلاهک قارچ

2- لکه ها و زخم های بافت مرده که در غالب ارقام و در تمام مراحل توسعه شامل گره زايی، ته سنجاقی شدن مرحله دکمه ای و مرحله بلوغ کامل بروز می کند. لکه های مذکور ابتدا به صورت نقاط آبسوخته، در سطح کلاهک ظاهر شده و سپس تبديل به لکه ها يا زخم های بافت مرده به رنگ قهوه ای مايل به خاکستری يا قهوه ای روشن، با حالت نا منظم و سطحی بر روی کلاهک قارچ خوراکی مشاهده               می شوند؛ در مرحله توسعه بعدی به صورت لکه های قهوه ای تيره که در نهايت با آميزش، ارزش اقتصادی، بازار پسندی، کيفيت و کميت قارچها به شدت کاهش می دهند (شکل 2).

3- ترکيدن و پوست کنده شدن پايه؛ ايجاد علائم به صورت شکاف در سطح کلاهک و ساقه، پوست کنده شدن ساقه، متورم و غير طبيعی شدن شکل آنها که در نهايت باعث نابود شدن بافتها و چرمی شدن آ نها     می شود. اين علائم به شدت باعث پائين آمدن ارزش قارچها می شود. در ضمن در تعدادی از قارچ ها که مورد حمله قارچ عامل بيماری قرار گرفته اند، هيفهای عامل بيماری به صورت پنهان باقی مانده و در مرحله بعدی، يعنی در حين حمل و نقل، در انبارها و فروشگاهها به رشد و توسعه خود ادامه داده و باعث شدت خسارت می شود. علاوه بر اين هم در بسترهای کشت و هم در ساير موارد، قارچهای ديگری از قبيل کپک خاکستری و سفيد بر روی لکه ها رشد کرده و باعث افزايش هر چه بيشتر خسارت می شوند (شکل 3 )،(2).

                          شکل2                                                                          شکل3

شکل 2 -  مرحله پيشرفته بيماری ورتيسيليومی قارچ  Verticillium fungicola var fungicola

شکل 3 -  مرحله پيشرفته بيماری  ور تيسيليومی قارچ Verticillium fungicola var fungicola که حالت ترکيدن و پوست کنده شدن پايه قارچ را نشان می دهد.

برخی از پژوهشگران گزارش کرده اند که قارچ ها می توانند بدون علائم روی محيط کشت بمانند و قبل يا درست بعد از برداشت، لکه ها گسترش پيدا کنند. اين قارچ ها وقتی که به قفسه های انبار می رسند ممکن است قابل فروش نباشند. اما مهمتر از اين، ممکن  است اسپور های قارچ بيماری زا در اطراف محيط پرورش قارچ خوراکی پخش شوند,(North and Wuest, 1993) (6).

عامل بيماری حباب خشک

اين قارچ انتشار جهانی دارد. به لحاظ رده بندی در دسته Prostrata قرار می گيرد. عامل بيماری حباب خشک يا بيماری ورتيسيليومی، روی قارچ خوراکی دکمه ای در منابع به سه گونه قارچ انگل اشاره شده است که عبارتند از؛ Verticillium fungicola, Verticillium malthousei, Verticillium psalliotae

گونه V. fungicola ابتدا به وسيله پريوس (1851) ، از قارچهای کلاهدار سمی و چوبزی مورد بررسی، جداسازی و تشخيص داده شد و پس از توصيف قارچ بيمارگر، نام آن Acrostalagmus fungicola   ناميده شد. بعد ها جنس Acrostalagmus  به عنوان همنام برای جنس ورتيسيليوم به کار رفته است.

 در بيشتر منابع گونه V. fungicola به عنوان همنام برای گونه V. malthousei بيان شده است و اين دو گونه همنام يا مترادفند.

گونه Verticillium psalliotae هم می تواند عامل بيماری حباب خشک يا مول خشک روی قارچ خوراکی دکمه ای باشد، ولی با توجه به اينکه در اغلب موارد گونه  Verticillium fungicolaاز قارچهای آلوده و بسترهای کشت جداسازی شده، بيشتر از گونه های ديگر مورد توجه قرار گرفته است. اين گونه با دو رقم، اساسا بر حسب نوع علائم ايجاد شده و مقاومت نسبت به حرارت، تقسيم بندی می شوند.

1)      Verticillium fungicola var fungicola

2)      Verticillium fungicola var aelophylum

پريوس در سال 2001 علاوه بر اين دو واريته، واريته ای با نام Verticillium fungicola var flavidum نيز اشاره کرد. او براساس رده بندی مرفولوژيکی و بيماريزا بودن اين سه واريته را در مورد اين قارچ مشخص کرد. کنيدی های واريته  V. fungicola var aleophilum از لحاظ شکل و اندازه خيلی متنوع هستند و شبيه V. fungicola var fungicola    می باشند. واريته flavidum  با دو واريته ديگر در حداقل درجه حرارت اپتيمم فرق دارد، همچنين از لحاظ وجوداسکلروتيا، کلنی زرد رنگ، بوی تند و غير بيماری زا بودن روی قارچ دکمه ای نيز با دو واريته ديگر تفاوت دارد. تنها اختلاف پيوسته بين   V. fungicola var fungicola    و V. fungicola var aelophylum    درجه حرارت ماکزيمم برای رشد ايده آل است(2و7).

اين قارچ از رده قارچهای ناقص، راسته مونی لياز و از خانواده مونيلياسه می باشد. جنس ورتيسيليوم از شاخه Deutromycota و شبه رده هيفوميست ابتدا به وسيله اسحاق چهار گونه به آن نسبت داده شده است. اين جنس دارای کنيدی برهای عمودی، خوابيده، شاخه دار و شاخه های کوتاه با گره می باشد. قسمت های انتهايی شاخه های کنيد برها معمولا فلاسک شکل و دارای منفذ ( فياليد) بوده و کنيديها در قسمت انتهايی کنيدی برها حمل شده و به صورت منفرد يا در دسته و گروه های کوچک قرار دارند. کنيديها تک سلولی، تخم مرغی شکل، بيضوی تا کروی و دارای رنگ روشن تا قهوه ای پرتقالی می باشند. به تازگی جنس ورتيسيليوم به چهار بخش تقسيم شده است(Gams & Vanzaayen, 1982).

جنس ورتيسيليوم دارای طيف وسيع ميزبانی بوده و تعدادی از گونه های ورتيسيليوم انگل قارچهای خوراکی ( کلاهدار)، حشرات، نماتدها و نيز به تعداد زيادی از گونه های گياهان آوندی و غير آوندی با اهميت اقتصادی فراوان، حمله می کنند. (Gams & Vanzaayen, 1982, Harper & Huang, 1986, and Kerry, 1990) مهمترين گونه های جنس ورتيسيليوم عبارتند از  Verticillium dahliaeو V. albo – atrum، که باعث پژمردگی و خسارت شديد در طيف وسيعی از محصولات جنگلی، زراعی، باغی، سبزيجات، صيفيجات و گياهان زينتی می شوند. اغلب گونه های جنس ورتيسيليوم بعد از 7 تا 10 روز، در شرايط تاريکی و دمای 20 تا 23 درجه سانتی گراد، معمولا روی هر محيط استانداردی از قبيل CMA، MEA، MA و PDA کنيديهای فراوانی توليد می کند(2).

مشخصات ميکروسکوپی قارچ Verticillium fungicola

اگر بتوانيم اسپورها را در زير ميکروسکوپ اندازه گيری کنيم، اسپورها حدود 10- 8 ميکرون طول و 3- 1 ميکرون عرض خواهند داشت و در نوک 1- 5/0 ميکرون نوک تيز شده اند(6).

کشت های خالص به آسانی بر روی محيط های OA و PDAدر دمای 25 درجه سانتی گراد رشد می کنند. کنيدی برها فراوان، عمودی با دو تا پنج گروه (Whorl) و در کشتهای کهنه تا 10 گره که در قاعده فياليدها قرار گرفته اند. هر گره دارای سه تا نه فياليد، با ابعاد 5/2 -2 × (35) 25 - 13 ميکرومتر ( حداقل عرض فياليدها به 5/0 تا 1 ميکرون هم می رسد). کنيديها دارای نوکهای تقريبا کروی، لزج و چسبناکند. اغلب از سمت نوک، به صورت منفرد از فياليد جدا شده و همراه با بقيه کنيديها، يک توده يا توده های بزرگی از کنيديهای لزج و چسبناک را تشکيل می دهند.

شکل کنيديها به صورت بيضوی کشيده تا استوانه ای يا سيلندری شکل، دو سمت آنها به صورت  بر آمده و نوک تيز نيستند. گاهی اوقات کنيديها در امتداد طولی خميده و تا حدودی هلالی شکلند. نوع استوانه ای يا سيلندری شکل کنيديها در کشتهای تازه يا ايزوله های جوان بيشتر تشکيل می شود. ولی در کشت های کهنه و مسن نوع خميده شکل کنيدی غالب است. اندازه کنيديها    5/2 - 1× 5/8 - 3 ميکرون است. وجود کلاميدوسپور گزارش نشده است(2).

علائم بيماری

علائم بيماری حباب خشک ابتدا به وسيله پريوس (1851)، اسميت (1924)، وار(1933) و هاس براک (1936) مورد بررسی و گزارش شده است. آنها در بررسيهای خود يافتند که اين بيماری با حمله به قارچ خوراکی باعث خسارات سنگين می شود.

وار(1933) اولين گزارش مبسوط، در مورد علائم بيماری حباب خشک روی قارچ خوراکی دکمه ای را ارائه داده است. در اوايل قرن بيستم، مالتوس، با تحقيقات خود متوجه خسارات سنگين و هنگفت اين قارچ  بر روی قارچ خوراکی شد، و توانست با جداسازی و خالص کردن بيمارگر، پاره ای از علائم بيماری را شرح دهد. از اروپا تريشو (1941) علائم بيماری حباب خشک با گونه V. psalliotae را ذکر کرد، با بررسی آثار تعدادی از عوامل محيطی بر روی رشد آن، خسارت سنگين و جدی اين قارچ بيمارگر را گزارش کرد.

وار(1933) گزارش کرد که رشته های ريسه بيمارگر در بافت مرده وجود دارد و در فاصله محدودی از محل آلودگی نيز يافت می شود. وار و متيوس (1983) گزارش کردند هر جا هيف های قارچ بيمارگر با سلولهای هيفی A. bisporus  برخورد و تماس پيدا می کنند، سلولهای هيفی قارچ خوراکی نابود می شوند. در اين بررسيها هيچ اثری از ساختمانهای نفوذی ( از قبيل ميخ رخنه) چه به وسيله مشاهدات ميکروسکوپ نوری و چه ميکروسکوپ الکترونی ديده نشد.

فکت (1967) با بررسيهای خود بر روی بيولوژی و عوامل محيطی موثر در رشد و اسپورزايی عامل بيماری حباب خشک، گزارش کرد که نوع علائم بيماری، به غلظت ماده تلقيح و زمان آلودگی ميزبان بستگی دارد. سيندن (1971) گزارش کرد بيماری ناشی از گونه V. fungicola بر روی قارچ خوراکی سه نوع علائم کلی دارد و نوع علائم، بستگی به زمان رشد و مرحله آلودگی ميزبان دارد. در صورت آلودگی در مراحل اوليه رشد، علائم حباب خشک شده و آلودگی در مرحله بعدی باعث ايجاد لکه های آبسوخته و سپس زخمهای بافت مرده در سطح کلاهک و شکاف در ساقه می شود.

مور و وست (1973) نشان دادند درجه و شدت علائم بيماری، به طور مستقيم با غلظت ماده تلقيح ارتباط داشته و تغيير می کند. فلاچر و همکاران (1989) در کتاب خود نوع علائم بيماری ناشی از حمله ور تيسيليوم را با زمان شدت آلودگی مرتبط می دانند. نورث و وست (1993) در بررسيهای الکترون ميکروسکوپی و کاربرد غلظتهای مختلف اسپور برای تلقيح عامل بيماری به ميزبان، دريافتند که نوع علائم ايجاد شده به وسيله گونه V. fungicola به زمان آلودگی، غلظت ماده تلقيح به کار رفته، مدت زمان فاصله بين آلودگی تا برداشت محصول و دوره کمون بيماری بستگی دارد. آنها در بررسيهای الکترون ميکروسکوپی، ارتباط نزديک هيفهای بيمارگر و ميزبان را مشاهده و گزارش کردند با تماس هر نقطه بين هيفهای بيمارگر و ميزبان، سلولهای هيفی ميزبان نابود شده، و هيچگونه اثری از تشکيل ساختمانهای نفوذی آلودگی از قبيل ميخ رخنه، هوستوريوم و غيره به وسيله بيمارگر مشاهده نخواهد شد. ميسليوم های V. fungicola روی اسپان قارچ خوراکی جوانه می زنند و بيماری توسعه می يابد. از زمانيکه اسپور قارچ V. fungicola جوانه می زند تا زمانيکه علائم روی قارچ خوراکی گسترش می يابد، حدود 14 روز است.

ويژگی مورفولوژيکی مهم درانتشار اسپورها اين است که اين اسپورها در يک بافت زايشی ژلاتينی توليد   می شوند اين ماده سفت و چسبناک، همه اسپورها را جمع کرده و کنار هم نگه می دارد.اين ماده چسبناک همچنين ماده ای است که اسپورها را به مگس ها، کارگران و تجهيزات می چسباند(2 و6).

وقوع و  خسارت بيماری در اثر حمله V. fungicola

اولين گزارش در مورد خسارت و بازدانگی روی قارچ Agaricus به وسيله پريوس (1951) صورت گرفت، و به طور قطع و با استناد به منابع ورتيسيليومی قارچ دکمه ای ( حباب خشک) از دير باز روی قارچ خوراکی خسارت ايجاد می کرده است. بخصوص در زمانی که رطوبت نسبی و درجه حرارت در سالنهای کشت بالا بوده باشد و عمل تهويه نيز بخوبی صورت نگيرد، خسارت عامل بيماری بسيار افزايش می يابد.

اسميت (1924) بيماری حباب خشک را به عنوان تهديدی جدی برای کشت و پروش قارچ خوراکی ذکر کرده و علائم و خسارت سنگين اين بيماری را مورد بررسی قرار داده است.

وار (1933) با مطالعه بر روی نوع علائم، منابع آلودگی و پاره ای از خصوصيات بيولوژيک عامل بيماری حباب خشک، گزارش کرد که رشته های هيفی قارچ بيمارگر در بافت مرده و نواحی اطراف آن وجود دارد. وی بدين طريق بيماريزايی قارچ را به اثبات رساند.

همچنين بيماری حباب خشک به عنوان عاملی مخرب، تهديد جدی و مشکلی مداوم برای پرورش دهندگان قارچ خوراکی در طی سالهای متمادی از کشورهای امريکا، کانادا، نقاط مختلف اروپا و ايران گزارش شده است.

( Orthon, 1923; Ware, 1933; Hassebrauk, 1936; Treschow, 1941; Fkete, 1976; Gandy, 1973; Harver et al., 1982; Matthwes, 1983; Rinker & Wuest, 1987; Fletcher et al., 1989; Spadafora et al., 1989; Holmes, 1991; and North & Wuest, 1993.)

فلاچر و همکاران (1979) بيمارگر V.fungicola ساليانه باعث خسارت در حدود 10 درصد از مجموع کل توليد قارچ خوراکی دکمه ای شده و يکی از عوامل خسارت زا روی بستر قارچ خوراکی دکمه ای است. در انگلستان قارچهای بيماريزای V. malthousei, Mycogone perniciosa وCladobotryum dendroides ساليانه بين 5/7 تا 25 درصد خسارت وارد ساخته اند.

ونگ و پريس (1987) با بررسی منابع آلودگی و عامل بيماری حباب خشک، خسارت ناشی از اين بيماری را بسيار سنگين دانسته و بيماری حباب خشک را به عنوان عامل تهديدی جدی برای صنعت کشت و پرورش قارچ خوراکی دکمه ای در انگلستان گزارش کردند(2).

بقای انتشار و منبع آلودگی

ماتروشوت (1914) رطوبت بالای سالنهای کشت و وجود لايه ای از رطوبت روی اندام باردهی قارچ خوراکی را از جمله شرايط بسيار مناسب برای بيماری ذکر کرده است. وجود رطوبت در سطح کلاهک قارچ خوراکی، رطوبت بالای سالنهای کشت، مرطوب بودن خاک پوششی و افزايش دمای سالن بين 20 تا 28 درجه سانتی گراد و تهويه ضعيف از مهمترين عوامل مستعد برای توسعه سريع بيماری حباب خشک محسوب می شود.

(Ware, 1933; Treschow, 1941; Wuest, 1965; Fekete, 1967; Sinden, 1971; Gandy, 1973; Fletcher et al., 1984; Spadafora, Wuest and Rinker, 1989.)

وار (1933) نشان داد کنه ها می توانند اسپور عامل بيماری را حمل کنند. فکت (1967) گزارش کرد علاوه بر کنه ها، دستهای کارگران سالنها و برداشت کننده ها نيز ماده تلقيح عامل بيماری را حمل کرده و باعث انتشار بيماری می شوند. آسانترين و معمولی ترين روش برای پراکندگی اسپورها از طريق آب است(Cross and Jacobs, 1969). بخار آب (مه) می تواند اسپورها را به سرعت به اطراف انتقال دهد.

کراس و جاکوبس (1968) پس از بررسيهای خود گزارش کردند مگس های قارچ خوراکی        hahterata)   Mgaselia   و  Leptocera heteoneura) نقش مهمی در انتقال قارچ عامل بيماری حباب خشک دارند. مطابق اظهار نظر هولمز (1971) اسپورهای V. malthousei نقش خيلی مهمی در انتشار آنها دارد و انتشار اصلی آنها به وسيله پخش قطرات ريز آب بوده است، ولی مگسها، کنه ها، کارکنان سالنها، ابزار برداشت از قبيل چاقو و قيچی و غيره و وسايل و قطعات آلوده شده، نيز هر کدام نقش مهمی را بازی   می کنند، ولی اهميت آنها به اندازه پخش از طريق ترشح قطرات آب آلوده نيست.

سيندن (1971) نتيجه گرفت که اسپورهای عامل بيماری احتمالا با جريان هوا از قارچهای وحشی آلوده به کشت و صنعتهای پرورش قارچ خوراکی می رسد.

گاندی (1972) با بررسيهای خود گزارش کرد آبياری هوايی يک بستر و محصول آلوده با شلنگ آبياری، توليد مه غليظی از اسپورهای ورتيسيليوم می نمايد که نقش خيلی مهمی در انتشار آلودگی دارد. از طرف ديگر او ملاحظه کرد دستکشهای پلاستيکی، رو کفش و زيرکفشها و چاقوهای برش دهنده منبع قابل  توجهی از آلودگی را تشکيل نمی دهند. گاندی اظهار داشت آلودگيهای اوليه احتمالا از ذرات گرد و غبار ناشی از عمليات تعمير، ساختمان سازی و غيره منشا می گيرند.

فلاچر و همکاران (1989) در کتاب خود، منابع آلودگی و عوامل انتقال آن را قطرات آلوده آب آبياری، کارکنان سالنها، برداشت کننده ها، مگس ها، کنه ها، ابزار برش، دستها، لباس، کفش ها، آبياری بسترها، ريزش آب از بسترها به سمت بسترهای پايين،   تخته های چوبی، منافذ ساختمانها و کف سالنها، بقايای خاک پوششی و کمپوست و بخصوص آلودگی خاک پوششی را خيلی سنگين گزارش می کنند.

آنها چسبنده بودن اسپورهای عامل بيماری را از مهمترين عوامل برای سهولت انتقال و گسترش سطوح آلوده دانسته اند.

ونگ و پريس (1987) نيز با بررسيهای دقيق خود بر روی منابع مختلف V. fungicola در انگلستان   اظهاراتی مشابه اظهارات فلاچر و همکاران (1989) بيان کردند(2،6 و14).

محيط کشت، احتياجات غذايی و حرارتی

آسانترين روش برای تشخيص اين پاتوژن کشت آن روی محيط کشت انتخابی است. اين محيط کشت های انتخابی به منظور رشد سريع ورتيسيليوم نسبت به هر يک از رقيبهای آن تغيير يافته اند.شرح جزئيات چگونگی تهيه اين محيط کشت ها توسط رينکر و همکارانش در سال 1993 شرح داده شده است. زمانيکه ورتيسيليوم بر روی محيط کشت سيب زمينی- دکستروزآگار(PDA)، در اتاق معتدل رشد داده می شود، کلونی های آن سفيد هستند و کناره های زير پليت بی رنگ تا زرد است. بعضی کشت ها ممکن شکلی  دايره ای با حاشيه گنکره دار داشته باشند(6).  

فکت (1967) گزارش کرد قارچ V. fungicola روی محيط PDA رشد خوبی دارد. رنگی و محيط کشتهای مختلفی را برای بررسی رشد بهينه و اسپورزايی V. fungicola مورد بررسی قرار داده و گزارش کرد که ترکيب محيط کشت می تواند بر روی ميزان رشد و شدت اسپورزايی تاثير داشته باشد. شرايط گرم و مرطوب برای رشد و توليد مثل V. fungicola   در جهت رشد سريعتر مطلوب می باشد(2 و6).

آزما و توزسولت (1972) در بررسيهای خود، بهترين منبع کربن برای رشد و اسپورزايی قارچ                     V. fungicola را گلوکز و بهترين منبع ازت را در درجه اول گلوتامين و گلوتاميک اسيد و در درجه دوم سولفات آمونيوم و نيترات آمونيوم گزارش کرند. ونگ و پريس (1987) به منظور رشد و اسپورزايی           V. malthousei يک محيط ترکيبی از مواد معدنی ساده را ارائه داده از مواد آلی، قند رافينوز را به عنوان يک منبع کربن خوب، برای استفاده عامل بيماری حباب خشک انتخاب کردند. زيرا اين قند به آسانی به وسيله قارچهای رقيب، مورد استفاده قرار نمی گيرد. محيط ارائه شده به اندازه کافی انتخابی نبود تا اينکه رينکر، بوسمن و آلم (1993) يک محيط کشت کاملا انتخابی برای رشد قارچ V. fungicola ارائه دادند.کوتزی و ايکر (1991) با بررسی منابع مختلف کربن و ازت، آثاردرجه حرارت و نور بر روی ميزان رشد و اسپورزايی V. fungicola ، قندهای گلوکز، گالاکتوز، مانوز، سوکروز و مانتيول را به عنوان بهترين منابع کربن و بهترين منبع ازت را به ترتيب گلوتاميک اسيد ، گلوتامين، نيترات سديم و نيترات آمونيم و دمای بهينه را بين 22 تا 24 درجه سانتی گراد برای رشد و اسپورزايی V. fungicola گزارش کردند.

کوتزی و وست (1991) و فکت (1967) با تحقيق در مورد تأثير دماهای مختلف بر روی ميزان اسپورزايی قارچ  V. fungicola، با شمارش اسپورها دريافتند که ميزان توليد اسپور در دمای مختلف به طور قابل توجهی اختلاف داشته و تقريبا با نيازهای حرارتی قارچ انگل در مرحله رشد رويشی ميسليوم منطبق است.

درجه حرارتهای پيشينه، بهينه و کمينه برای رشد اسپورزايی V. fungicola را به ترتيب 32 تا 35، 20 تا 25 و صفر تا چهار درجه  سانتی گراد گزارش کردند. (Treschow, 1941; Fekete, 1967; Heuel and Weltzein, 1982; Bech et al., 1989; Coetzee and Eicker, 1991.)

لامبرت و وست (1979) و بچ و همکاران (1989) تغييرات ذاتی و قابل توجه (Intra Specific) را در تعدادی از ايزوله های مختلف V. fungicola نسبت به تاثير دما بر روی ميزان رشد رويشی و ميزان اسپورزايی آن گزارش کردند.

کوتزی و ايکر (1991) در مورد تأثير نور بر روی رشد رويشی و ميزان اسپورزايی قارچ V. fungicola، پس از بررسيهای خود گزارش کردند که نور تاثير قابل توجه و معنی داری بر روی ميزان رشد رويشی نمونه های قرار گرفته در تاريکی و روشنايی ندارد؛ ولی به طور معنی داری تيمارهای موجود در برابر نور، نسبت به تيمارهای قرار گرفته در شرايط تاريکی، اسپورزايی شديدتر و بيشتری از خود بروز می دهند. در ايران بختياری و همکاران (1377) تاثيرات مواد غذايی، pH و درجه حرارت را بر روی رشد اين قارچ مورد بررسی قرار داده و ضمن تعيين شرايط رشدی مناسب اعلان کرده اند که کاهش درجه حرارت سالن و تنظيم درجه حرارت سالن مناسب، می تواند در کنترل بيماری، موثر باشد.

دستکاری شرايط محيطی ميزان گسترش بيماری را کاهش می دهد. کاهش درجه حرارت محيط از 20 به 14 درجه سانتی گراد و رطوبت نسبی از 90 درصد به 80 درصد برای چند روز درصد آلودگی قارچها را کاهش می دهد .(Nair and Macauley, 1986) در صورتی می توان اين شرايط را بکار برد که عوامل بيماريزای ديگر مثل لکه قهوه ای باکتريايی موجب بيماری نشود(2 و6).

آناليز فيلوژنتيکی V. fungicola و گونه های نزديک آن

بيدوچکا و همکاران توليد آنزيم های هيدروليز کننده و انجام آزمايشات پاتوژنيکی قارچ را به لحاظ بيماريزايی در يک گياه و يک حشره ميزبان به منظور بدست آوردن نگرشی در تکامل بيماريزايی گونه های V. fungicola بررسی نمودند. علاوه بر اين، در يک آناليز ترتيبی در جنس Verticilliumتوسط            ناحيه نويسی داخلی (ITS1) و همچنين بخشی از زير واحدهای کوچک RNA ريبوزومی هسته را انجام دادند، داده های حاصل در تهيه اطلاعات در مورد تغيير پذيری ژنتيکی در بين 13 گونه مختلف Verticillium مورد استفاده قرار گرفت. از دو قارچ دو ايزوله از V. fungicola از دو ميزبان ( قارچ و راسته بال پولک داران) برای آناليز سير تکاملی DNA ريبوزومی هسته آنها و توليد آنزيم های خارج سلولی استفاده گرديد. عليرغم شباهت های فيزيولوژيک اين دو ايزوله در نوع پروتئاز، پکتيناز، چيتيناز، تحليل ترتيبی DNA ريبوزومیITS1 (ناحيه داخلی ترانويسی شده يک)، چيزی حدود 3/49 درصد تفاوت بين     دو ايزوله ديده شد. اين نتايج از منوفيلی قارچ V. fungicola و همچنين امکان وجود گوناگونی سطح بالا در جمعيت V. fungicola را حمايت نمی کند. بنابراينVerticillium  ممکن است از يک منوفيل و در نتيجه از يک جنس تشکيل شده باشد. گوناگونی يا تفاوتهای ژنتيکی بين ايزوله های جنس Verticillium قبلا توسط بونن و هوپکينز مورد بررسی قرار گرفت. اينان از روش تحليل DNA تقويت شده چند شکلی به طور تصادفی، برای تعيين تغييرات در محدوده گونه های اين موجود زنده استفاده نمودند. 66 ايزوله جمع آوری شده در طول يک دوره 45 ساله (1950 تا 1995) با توجه به شکل کلنی، پاسخ به قارچکشها، عفونت زايی، منشأ جغرافيايی و گروه بندیRADP مقايسه شدند. زمانيکه تمام 66 ايزوله با هم آناليز شدند، هيچ رابطه ای بين گروه بندی RADP، شکل کلنی و عفونت زايی آنها ديده نشد. اگر چه همه ايزوله های جمع آوری شده قبلی به لحاظ پاسخ به قارچکش ها، عفونت زايی، شکل کلنی، منشا جغرافيايی و گروه بندی RAPD با هم شبيه بودند. اين سطح بالا از هموژنيتی بين ايزوله های اخير از گونه V. fungicola با نتايج حاصل توسط بيدوچکا و همکارانش در تضاد بود و پيشنهاد کرد که يک کلنی جمعيتی از V. fungicola ممکن است مسئول شيوع بيماری اخير حباب خشک در مزارع قارچ تجاری (دکمه ای) باشد. هدف اين مطالعه تعيين کردن توانايی تغييرات ژنتيکی ايزوله های قارچ V. fungicola مسئول بيماری اخير حباب خشک در قارچهای تجاری بود. تحليل تربيتی بخشی از DNA ريبوزومی هسته ای، بويژه ITS1 و ITS2  و ژن 5/8S rRNA برای آزمايش گوناگونی ژنتيکی در بين اين گونه ها انجام شد. ايزوله های جمع آوری شده از مناطق جغرافيايی مختلف در طی 50 سال گذشته در جهت درک چگونگی تغييرات ژنتيکی مختلف اين عامل بيماريزا در طول زمان  را شامل شده است. درک بهتری از ساختار ژنتيک جمعيت موقتی V. fungicola در جهت مشخص کردن وشناخت جغرافيايی زيستی آنها مفيد است. علاوه بر اين برای مقايسه rDNA  از  ايزوله های مختلف جمع آوری شده در طی 50 سال گذشته، يک آناليز PAPD  انجام گرفت. اين باعث شد که يک ارزيابی ژنتيکی از ايزوله های جمع آوری شده در سال 1999 از 27 محيط پرورش قارچ در جنوب شرقی پنسيلوانيا انجام شود.

40 ايزوله V. fungicola که جداسازی شده بودند از A. bisporus ، از 27 محيط پرورش قارچ در جنوب شرقی پنسيلوانيا در سال 1999 جمع آوری شد. محيط های کشت تک اسپوری از هر ايزوله رشد نمود تا از يکسان بودن ژنتيکی آنها قبلا از تجزيه و تحليل مولکولی مطمئن شويم. انواعی از استرين برای سه واريته    V. fungicola از مرکز کشت اسچيمل در هلند بدست آمد. براساس نتايج بدست آمده، رديف های توالی نوکلئوتيدی مستقل بين نوعی استرين واريته هايی از V. fungicola  تغييری در حد 5/16درصد نشان داد. بيشترين تغيير مربوط به اختلاف نوکلئوتيدی بين قطعات V. fungicola var. fungicola و V. fungicola var. flavidum در حد4/16درصد بود. بدنبال تغييرات بين توالی V. fungicola var. aleophilum و               V. fungicola var. flavidum  5/15درصد بود. تغييرات توالی نوکلئوتيدی در حد بسيار کم(5/1 درصد) بين نوعی از استرينهای V. fungicola var. fungicola  وaleophilium V. fungicola var. مشاهده شد.

تمام ايزوله های جمع آوری شده از محيط های پرورش قارچ خوراکی در پنسيلوانيا در سال 1999، در گروه V. fungicola var. aleophilum با 14 ايزوله از کلکسيون  دانشگاه پنسيلوانيا قرار داده شد. هيچ تغيير توالی در V. fungicola var. aleophilum وجود نداشت به استثنای يک مورد تغيير جايگزين در محدوده ناحيه ژنی ITS2 از ايزوله DC130  از کره. نتايج حاصل از تحليل توالی بيشتر توسط تحليل RAPD حمايت شده است. تمام ايزوله های جمع آوری شده از محيط های پرورش قارچ خوراکی در پنسيلوانيا، شناسايی الگوهای RAPD برای تمام پريمرها فراهم آورد. هر يک از 18 ايزوله برای سطح عفونت زايی روی قارچ  A. bisporus  ارزيابی گرديد. تمام ايزوله های گروه های V. fungicola var. aleophilum  و                          V. fungicola var. fungicola باعث شديدترين علائم بيماری روی A. bisporus  می شوند. آب استريل مورد استفاده و بعضی از ايزوله هایPSUCC DC131) و (DC124 ،  V. fungicola var. flavidum  و               V. terenum باعث ايجاد علائم نشدند.

يک مجموعه از آناليز NJ(neighbor-joining) از توالی های ITS1 ،ITS2 و5/8S استنباط گرديد. دو مورد از اين گروهها، V. fungicola var. aleophilumو V. fungicola var. fungicola که شامل ايزوله های مسئول شيوع بيماری اخير حباب خشک به استثناء ايزوله DC130 کره ای، در اروپا و آمريکای شمالی        بوده اند. سطوح مشاهده شده از اختلاف بين ايزوله های اروپايی و آمريکای شمالی با محل جغرافيايی پيوستگی دارند. ايزوله های اروپايی دارای توالی نوکلئوتيدی (r DNA) يکسانی در V. fungicola var. fungicola می باشند. اصولا هيچ ايزوله ای از گروه اروپايی در مزارع قارچ امريکای شمالی رديابی نشده است. ايزوله های مسئول بيماری حباب خشک در آمريکای شمال دارای توالی يکسانی در ITS1، 5/8S و ITS2 rDNA  و V. fungicola var. aleophilum می باشند. اگر چه V. fungicola var. aleophilum در اروپا جمع آوری شده و V. fungicola var. fungicola شايعترين عامل بيماری حباب خشک در               A. bisporus در آن قاره می باشد. آناليز توالی کپک سبز بيماری زا Trichoderm harzianum نيز پديده مشابه جغرافيايی را نشان دادند. دو بيوتيپ (Th2,Th4) از Trichoderm harzianum مسئول بيماری اپيدمی کپک سبز در اروپا و آمريکای شمالی به ترتيب هستند.

آناليزهای اخير مورفولوژيک و بيماری زايی سه واريته از گونه های V. fungicola را شرح می دهد. آناليز توالی مولکولی انجام شده در اين مطالعه فقط از دو  واريته اين گونه حمايت می کند. داده های توالی دلالت بر اين دارد که V. fungicola var. flavidum و V. tenerum که به گونه ای متفاوت و وابسته با ساير استرين های آزمايش شده بودند و به عنوان بخشی از يک گروه مورد توجه قرار نگرفت. تفاوت توالی در بين تمام انواع استرين واريته های از V. fungicola در 5/16درصد V. fungicola var. flavidum مسئول برای اغلب تغيرات مشاهده بود. اين نتايج دلالت بر اين دارد که V. fungicola var. flavidum نبايد بخشی از گونه پيچيده V. fungicola باشد. بر پايه تحليل توالی و عدم توانايی V. fungicola var. flavidum در ايجاد بيماری روی قارچ V. fungicola و تحقيق بيشتر و امکان حذف اين واريته از گونه V. fungicola به منظور کسب نتيجه در منوفيلی بودن دو واريته باقيمانده V. fungicola var. flavidum و V. fungicola پيشنهاد شد. ورتيسيليوم به عنوان يک جنس که به لحاظ مورفولوژيکی توضيح داده شده به نظر می رسد که پلی فيل باشد. در اين مطالعه اختلاف توالی بين نوعی از استرين Verticillium 9/34 درصد و اختلاف توالی در بين نوعی از استرين V. fungicola var. aleophilum، V. fungicola و V. tenerum 28درصد بود. سطح بالای اختلاف توالی بين اين دو واريته V. fungicola و V. tenerum اين پيشنهاد را پشتيبانی می کند که V. fungicola var. aleophilum و V. fungicola var. fungicola ممکن است گونه های ورتيسيليوم نباشند. اين ايزوله های توليد پروفيل های RAPD مشابه نمودند، اما نه مشابه با ساير ايزوله هايی از گروه               V. fungicola var. aleophilum. آناليزRAPD آشکار کرد که حداقل سه طبقه مختلف از ايزوله های شناخته شده و شناخته نشده به عنوان fungicola وجود دارد. کارهای قبلی توسط بونن و هايکينز فقط چهار گروه بندی RAPD را شناسايی کرده بودند. اضافه نمودن ايزوله های اروپايی و استرنهايی از V. fungicola به اين تحليل ها، مسئول مشاهده افزايش در تعداد گروه بندی RAPD بود. ميزان رشد بيشتر نوعی از استرين V. fungicola var. aleophilum در دمای 30 درجه سانتی گراد در مقايسه با 20 تا 24 درجه سانتی گراد برای نوع ديگری از استرين V. fungicola var. fungicola در ابتدا در تشخيص اين دو واريته مورد استفاده قرار گرفت. آناليز قبلی انجام گرفته توسط لامبرت اختلاف سرعت رشد بين ايزوله های کره و آمريکای شمالی که به عنوان V. fungicola نشان داده شده است.  لامبرت سرعت رشد بيشتری را در ايزوله های آمريکای شمالی در دمای 21 سانتی گراد مشاهده کرد. دو مورد از ايزوله های DC130 وDC123 در   مطالعه گنجانده شده بر پايه مشاهدات لامبرت به نظر می رسد که ايزوله DC123 بهV. fungicola var. aleophilum  ارتباط نزديکتری دارد. پايين ترين دمای مناسب برای رشد ايزوله DC123 و شباهت به تمام ايزوله های V. fungicola جمع آوری شده در سال 1999، ممکن است توضيح دهد که چرا اين بيوتيپ شايعترين عامل ايجاد بيماری حباب خشک در مزارع آمريکای شمالی است؟ ايزوله هايی که به اشتباه به عنوان V. fungicola از PSUCC در گروههای يک و دو قرار داده شدند، به عنوان ايزوله هايی از                  V. fungicola var. aleophilum و V. fungicola var. fungicola عفونت زا نبودند. ايزوله هايی از گروه يک و دو که اخيرا در محيط های پرورش قارچ روی آنها بررسی انجام نشده، نبايد به عنوان استرينهايی از  V. fungicola  بر پايه تحليل توالی rDNA  و سنجش بيماری زايی مورد توجه قرار گيرد. آناليز فيلوژنيک در مورد جنس ورتيسيليوم منوفيلی بودن V. fungicola   را براساس توالی های ITS و قسمتی از ژن               18S RNA را پشتيبانی نمی کند. تحليل های حاصل از توالی V. fungicola ، استفاده توالی rDNA  را از محصولات PCR تقويت شده  و داده های نوکلئوتيدی NCBI، چهار گروه اصلی حاوی استرين هايي که به عنوان V. fungicola   شناخته شده اند را آشکار ساخت. فقط استرين هايی با توالی مشابه rDNA به نوعی استرين V. fungicola var. fungicola و V. fungicola var. aleophilum در گروه های خواهر         گروه بندی شده اند. اين مشاهدات پيشنهاد می کند که V. fungicola var. flavidum را نبايد به عنوان واريته V. fungicola مورد توجه قرار داد، زيرا به علت اختلاف زياد در توالی ITS1 و 5/8S و ناحيه ژن ITS rRNA از دو واريته ديگر اين گونه می باشد. وضعيت رده بندی اين گونه مبهم است و بايد بررسی های بيشتر برای تعيين رابطه آن با گونه Acremonium، Helicoon و Orbilia لازم است. ايزوله های DC116 و DC124 از PSUCC با شباهت نزديکی در توالی های بدست آمده از Tolypocladium parasiticum (Beauveria parasitica) گروه بندی گرديدند، که يک پارازيت می باشد. جنس Tolypocladium از ورتيسيليوم توسط بازون و گامز جدا شد.

شايد جالب ترين قسمت اين تحليل رابطه توالی V. fungicola var. aleophilum و V. fungicola var. fungicola  با گونه Cordyceps و Paecilomyces  باشد. اين امکان وجود دارد که استرين هايی از گروههای V. fungicola var. aleophilum و V. fungicola var. fungicola قادرند حشرات را به عنوان ميزبان دوم پازايت کنند. در صورت وجود اين امکان درک فعلی ما از اپيدمی شناسی بيماری حباب خشک بايد توسعه يابد. در اين صورت توالی های ژنهای بيشتر و تحليل فيلوژنتيکی قسمت های ديگر ژنوم ها مانند بتاتوبولين در اين قارچ به منظور امتحان بيشتر خويشاوندی ژنتيکی از واريته های  V. fungicola                     با بيماری زايی حشرات مورد نياز خواهد بود(7).