قسمت سوم _ تأثير قارچ کش پرو کلورازMn- برساختارديواره سلولی Verticillium fungicola

تأثير قارچ کش پرو کلورازMn- برساختارديواره سلولی Verticillium fungicola

 اخيراً مطالعات ميکروسکوپی متفاوتی نشان داده است که پاتوژن های بيماريزا هم در داخل و هم بيرون قارچ A. bisporus رشد پيدا می کنند. به نظر می رسد فرآيند عفونت به واسطه توليد آنزيمهای خارج سلولی توسط V. fungicola می باشدکه اين امر خود منجر به مرگ بافتهای زنده (نکروز) و قهوه ای شدن قارچها می گردد. اين آنزيمها شامل آنزيمهای اگزوپلی ساکارديداز و آندوپلی ساکارديداز می باشد و همچنين پروتزهايی که توسط کالونجر و همکارانش تشخيص داده شده است. آزمايشات متعدد نشان داد بعضی موارد در حضور ميوه قارچ A. bisporus  افزايش می يابد و باعث تشديد بيماری می گردد .کنترل بيماری حباب خشک که توسط V. fungicola ايجاد شده است، از طريق به کار بردن مواد شيميايی، شرايط کشت و رعايت اصول بهداشتی امکان پذير است.

* تعداد و وزن اندام باردهی قارچ، نسبت به وزن کمپوست متوسط سه تکرار است.

جدول 1 - تاثير 10 نوع قارچکش بر ميزان محصول توليد شده در بسترهای تلقيح شده با قارچ  V. fungicola در مدت زمان 20 روز

محصولات شيميايی استفاده شده برای کنترل  V. fungicola  بايستی بسيار موثر و نافذ باشد و هيچ آسيبی به محصولات قارچی وارد نياورند. از سال 1985 کشاورزان اسپانيايی که قارچ می کاشتند، قارچکشهای زيادی بکار بردند همانند پروکلوراز- Mn . اين قارچ کش از مهمترين موادی بود که برای کنترل بيماری بکاربرده شد. در هر صورت آغاز سال 1992آلودگی قابل ملاحظه V. fungicola  در محصولات قارچ خوراکی عليرغم استفاده از قارچکشها مشاهده شد، که نشان می داد قارچهای عامل بيماريزا مقاومتشان نسبت به پروکلوراز- Mn افزايش يافته بود. مطالعات زيادی درباره قارچ کشهای  بسياری  صورت  گرفته  است  و

فعاليتهای اين نوع مواد نيز به دقت بررسی شده است. مثلاً  بيوسنتز استرول در بازدارنده ، همچون  پروکلوراز- Mn بدقت مورد مطالعه قرار گرفته است. اما متاسفانه مطالعات انجام شده بيش از يک مکانيزم بازدارنده را شامل نمی شود.مطالعه ساختار شيميايی ديواره هيفهای  V. fungicola  و همچنين تغييرات آناليزی احتمالی در ساختار شيميايی فوق ساختاری تشکيل دهنده   ديواره های سلولی V. fungicola نيز در اثر تيمار کردن با قارچ کش پروکلوراز - Mn  مورد بررسی قرار گرفت. در اين روش دو نوع ايزولهFungicola V. (nos. 210 and 100) توسط مرکز تحقيقات (CIES) فراهم شد. اين دو نوع ايزوله از اسپوروکارپهای آلوده شده از Castill-La Mancha در سال های 1992 تا 2000جمع آوری گرديد. يک استرين از Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS 992.69)  (به عنوان منبع ارگانيزم) که   جدا شده بود در سال 1969 قبل از استفاده از پرو کلوراز-Mn، استفاده گرديد. پروکلوراز- Mn 46  درصد بر محيط کشت Raper اضافه شد و بر اساس LD50  بکار گرفته شد. ارزيابی مقاديرLD50 از طريق کشت قارچهای بيماری زا در محيط کشت Raper در غلظتهای مختلف صورت گرفت. کشتهای انجام شده از طريق کاغذ 3 ميلی متر وات من در دستگاه صافی صورت گرفت و درنهايت فيلترهايی که حاوی ميسليومها شدند وزنشان اندازه گيری شد. نتايج 510 درصد کاهش در رشد ميسليومها نشان داد. برای آماده سازی ديواره سلولی ايزوله های V. fungicola را برای پنج روز بصورت ايستا در فلاسکهای مجزا پرورش دادند. اين فلاسکها حاوی 11 محيط کشت Raper بودند که در نهايت توده های قارچی توسط فيلتر کردن جداشدند، چندين بار با آب مقطرشسته شدند و بصورت خشک فريز شدند وتا مواد حاصل شده درمراحل بعدی بکار گرفته شوند. ميسليومهای خشک بصورت پودر در آورده شد و اين عمل در Sorvall ommixer انجام شد. سپس توسط Fritch 6 balls-mill جداسازی صورت گرفت. ديواره هيفها توسط شستن مکرر با آب مقطر پاک و تميز شد و اين عمل تا زمانی که پروتئين بطور کامل از ديواره ها جدا شد، ادامه يافت و   در نهايت بصورت خشک، فريز و برای مطالعات بيشتر نگهداری شد. جزبه جز ماده ديواره سلولی و ژل فيلتر شده ساکاريد قابل حل برای انجام تحقيقات بعدی حفظ و نگهداری شد. ماده خشک (3گرم) با 350 ميلی ليتر آب مقطر در دمای 60 درجه سانتی گراد به مدت 40 ساعت استخراج شد. بعد از سانتريفيوژ ديواره سلولی باقی مانده دو بار با آب مقطر شسته شدند و در نتيجه مواد شناور برروی آب و تميز کننده با آن ها ترکيب شدند. مواد خشک فريز شده و مواد متراکم واحد F1 را تشکيل دادند. مواد باقی مانده حاصل از تيمار با 350 ميلی ليتر از 1 N KOH در دمای 60 درجه سانتی گراد به مدت 48 ساعت پس از انجام مراحل خاص بصورت متراکم در آمدند. ماده حلال توسط آب روان دياليز گرديد. بعد از 24 ساعت که از دياليز آب گذشته بود دو قسمت مجزا گرفته شد، يکی ماده غير قابل حل در آب بود (F2I) که از طريق سانتريفيوژ و ماده خشک فريز شده بدست آمد و ديگری ماده قابل حل در آب بود (F2S) که در طول شب و دمای چهار درجه با دوحجم 96 درصد که حاوی اتانول نيز بود ته نشين گرديد. و در نهايت سانتريفيوژ شده و بصورت خشک فريز گرديد. ماده باقميانده ديواره سلولی که در آلکالی غير قابل حل بود با آب مقطر و مرتباً شسته شد. تا اينکه ذرات موجود در آن از آلکالی و ماده خشک فريز شده جدا شدند و به نام F3  ناميده شدند(شکل3).

 شکل 3-  جزء به جزء کردن ديواره سلولی

V. fungicola

نمونه های F1 و F2S (50 - 150 ميلی ليتر) در 1-3 ميلی ليتر از ماده 0.3 M NAOH حل گرديد و در 13000 گرم  به مدت 15 دقيقه سانتريفيوژ شد تا مواد غير قابل حل از آن جدا گردد. ذرات هر نمونه   باسفارز (205×100 سانتی متر) در ستون CL-6B قرار داده شدند. و با ماده 0.3 M NAOH شسته شدند. ميزان جريان آب 18 ميلی ليتر در ساعت  بود، واحدهای سه ميلی ليتری جمع آوری شده و بدقت برای  تعيين کربوهيدرات آنها مورد کنترل قرار گرفتند و اين عمل با استفاده از شيوه فنول- اسيد سولفوريک صورت پذيرفت. واحدهای مناسب ترکيب و دياليز شده و در نهايت بصورت خشک فريز شدند.

 برای انتقال ميکروسکوپی الکترون (TEM)  نمونه های از ديوارهای سلولی V. fungicola  از سه ايزوله که در حضور و عدم حضور قارچکش رشد کرده بودند. سپس نمونه های گرفته شده روی ميله های پوشيده از Formvar-coated grids قرار داده شدند و اجازه دادند تا خشک شوند و در معرض Au-Pd قرار گرفتند، و توسط سيستم ميکروسکوپی انتقال الکترون Philips EM 300 مورد ارزيابی قرار گرفتند.

نتايج حاصل از اين تحقيقات نشان می دهد که؛ ارزش مقادير LD50 قارچکشها برای ايزوله V. fungicola  از ppm51/0 تاppm 48/3 متغير بودند و درجات مقاومت متفاوتی داشتند که البته درجه مقاومت آنها بستگی به تاريخ ايزوله داشت. به منظور مطالعه اثر پروکلوراز- Mn بر ديواره سلولی V. fungicola  دو ايزوله CIES (210 و100) انتخاب شد وهمچنين ايزوله CBS به عنوان کنترل انتخاب شد. ترکيب شيميايی ديواره سلول سه ايزوله که در حضور و غياب قارچکشها رشد يافتند در جدول2 است.

جدول 2- ترکيب شيميايی کلی ديواره سلولی از سه ايزوله V. fungicola تيمار شده و تيمار نشده با   پرو کلوراز- Mn  

مقادير عددی کربوهيدرات خنثی همزمان با استفاده از پروکلوراز- Mn افزايش می يافت. در حاليکه ميزان پروتئين در ميزان های متفاوتی کاهش پيدا کرده و ميزان هگزوسامين( (hexosaminesبصورت متعادل باقی می ماند، که اين خود نشان می داد افزايش قابل ملاحظه ای در ايزوله CIS210 وجود دارد. ديواره سلولی شش واحد متفاوت را نشان داد که پنج تای آنها يعنی F1a، F1b، F2Sa، F2Sb و F3 حدود 75-80 درصد وزن کل ماده خشک که مربوط به ديواره سلولها بود نشان می داد و عمدتاً از پلی ساکاريد ساخته شده بود. در مقايسه واحد F2I مقدار کمی شکر خنثی داشت کمتر از 5 درصد و اساساً از ليپيد تشکيل شده بود.  تجزيه و تحليل کربوهيدرات ها که از واحدهای پلی ساکاريد گرفته بود، نشان داد تفاوت قابل ملاحظه ای در واحدهای گرفته شده می باشد و همچنين نشان داد که مقداری گلوکز در واحدهای F18 و F2Sb از ايزوله CBS وجود دارد و همچنين در دو ايزوله V. fungicola، CIES نيز اين واقعيت قابل درک است. لازم به ذکر است که ايزوله V. fungicola  از مزارعی گرفته شد که پروکلوراز- Mn مرتباً استفاده می شد. در مقابل مقدار گلاکتوز با توجه به اثر قارچکشها افزايش پيدا کرده و مواد باقی مانده تقريباً مقدار ثابتی داشتند. ايزوله CBS نشان داد که تأثير واضح تری نسبت به ايزوله های CIES بر مواد موجود در تحقيقات انجام شده داراست. اما بهرحال واحدهای F1a، F2Sa و F3 از سه ايزوله موجود فقط ازگلوکز تشکيل    شده اند و چه در حالتی که از سلول های در حال رشد گرفته شده بودند و چه بخاطر وجود يا عدم وجود پروکلوراز - Mn تفاوت چندانی را نشان ندادند(5).